Osservare la vita senza etichette al microscopio ottico

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 559 (2023) Citare questo articolo

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I microscopi ottici oggi hanno spinto i limiti della velocità, della qualità e dello spazio osservabile nei campioni biologici, rivoluzionando il modo in cui vediamo la vita oggi. Inoltre, l’etichettatura specifica dei campioni per l’imaging ha fornito informazioni su come funziona la vita. Ciò ha consentito alla microscopia basata su etichette di filtrare e integrarsi nella ricerca tradizionale sulle scienze della vita. Tuttavia, l’uso della microscopia senza etichetta è stato per lo più limitato, con conseguente test per la bioapplicazione ma non per la biointegrazione. Per consentire la biointegrazione, è necessario valutare la tempestività di tali microscopi nel rispondere in modo univoco alle domande biologiche e stabilire una prospettiva di crescita a lungo termine. L'articolo presenta i principali microscopi ottici senza etichetta e discute il loro potenziale integrativo nella ricerca sulle scienze della vita per l'analisi imperturbabile di campioni biologici.

Storicamente, la microscopia ottica si è evoluta parallelamente alle scienze della vita. Oggi, qualsiasi struttura di ricerca biologica standard è dotata di un microscopio per visualizzare morfologie in modalità campo chiaro e distribuzioni molecolari in modalità epifluorescenza per osservare strutture di interesse etichettate. Questa configurazione è il punto debole di un biologo poiché la maggior parte degli studi può essere eseguita con tale sistema o progettata per essere ospitata al suo interno. La necessità di quantificazione molecolare e di sezionamento ottico preciso ha reso la microscopia confocale a scansione laser una delle preferite dai biologi. Il crescente interesse per l'imaging rapido e in tempo reale di campioni spessi in 3D è servito come feedback tempestivo per sviluppare strumenti di imaging come i microscopi multifotonici1,2,3,4,5,6 e a foglio luminoso7,8,9. La necessità di osservare i cambiamenti dinamici cellulari ha incoraggiato metodi basati sulla fluorescenza come il trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET)10, 11, la microscopia per imaging a fluorescenza (FLIM)12,13 e il recupero della fluorescenza dopo fotosbiancamento (FRAP)14,15. L'importanza di osservare i minimi dettagli ha motivato metodi ad alta risoluzione come l'illuminazione strutturata (SIM)16,17, l'esaurimento delle emissioni stimolate (STED)18,19 e la microscopia a localizzazione di singole molecole (SMLM)20,21,22. Sistemi di supporto come telecamere più veloci, automazione adattiva ad alto rendimento e coloranti innovativi hanno ulteriormente ampliato notevolmente le bioapplicazioni. Tuttavia, esiste una lacuna in cui i metodi basati sulle etichette sono limitati, vale a dire nella valutazione chimicamente imperturbabile dei campioni biologici, senza alcun intervento di etichette e sostanze chimiche associate.

Molti metodi di imaging senza etichetta ben noti, nonostante i loro vantaggi, sono limitati quando l'obiettivo sono studi meccanicistici o scoperta di conoscenze. Ad esempio, la microscopia a campo chiaro, a contrasto di fase e a contrasto di interferenza differenziale (DIC) sono le scelte comuni dei biologi. La microscopia in campo chiaro è più adatta quando i campioni sono colorati con un colorante che conferisce il contrasto. Tuttavia, per gli studi dal vivo, ottenere immagini ad alto contrasto per cellule viventi quasi trasparenti è impegnativo. Il contrasto di fase e l'imaging DIC aumentano otticamente la differenza tra il campione e lo sfondo per generare un'immagine ad alto contrasto e vengono abitualmente utilizzati con la microscopia a fluorescenza. Sia il contrasto di fase che l'imaging DIC sono strumenti molto utili per un biologo. Ma non possono quantificare i cambiamenti di fase, poiché i valori di intensità sono correlati in modo non lineare alle informazioni di fase e quindi non possono essere ricondotti ai cambiamenti effettivi nel campione.

Oggi, il progresso nell'imaging senza etichetta ha consentito l'imaging ad alta risoluzione e ad alta velocità di morfologia, dinamica, funzionalità, scambio di materiali, interazione con agenti patogeni, biochimica e biomeccanica (Fig. 1). Questo articolo discute l'ampia selezione di diversi microscopi ottici senza etichetta, le loro applicazioni biologiche e il loro potenziale per diventare un potente strumento della ricerca biomedica tradizionale. Questo articolo, quindi, mira a stabilire le basi per la scelta di strumenti di microscopia ottica senza etichetta idonei per aumentare i metodi consolidati e infine svolgere un ruolo più integrativo nella scoperta della conoscenza.