Recupero parallelo dell'accessibilità della cromatina e della dinamica dell'espressione genica da cellule T regolatorie umane congelate

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 5506 (2023) Citare questo articolo

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Caratteristiche epigenetiche come l’accessibilità del DNA dettano la regolazione trascrizionale in modo specifico per tipo e stato cellulare, e la mappatura di questo rapporto tra salute e malattia in materiale clinicamente rilevante sta aprendo la porta a nuove intuizioni meccanicistiche e nuovi bersagli per la terapia. Il test per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (ATAC-seq) consente la profilazione dell'accessibilità della cromatina da input di cellule basse, rendendola trattabile su popolazioni cellulari rare, come le cellule T regolatorie (Treg). Tuttavia, si sa poco sulla compatibilità del test con popolazioni cellulari rare crioconservate. Qui dimostriamo la robustezza di un protocollo ATAC-seq che confronta le cellule Treg primarie recuperate da campioni PBMC freschi o crioconservati, allo stato stazionario e in risposta alla stimolazione. Estendiamo questo metodo per esplorare la fattibilità di condurre una quantificazione simultanea dell'accessibilità della cromatina e del trascrittoma da una singola aliquota di 50.000 cellule Treg crioconservate. La profilazione dell'accessibilità della cromatina e dell'espressione genica in parallelo all'interno dello stesso pool di cellule controlla l'eterogeneità cellulare ed è particolarmente vantaggiosa se vincolata da materiale di input limitato. Nel complesso, abbiamo osservato un’elevata correlazione tra modelli di accessibilità e dinamica dei fattori di trascrizione tra campioni freschi e crioconservati. Inoltre, profili trascrittomici altamente simili sono stati ottenuti da cellule intere e dai surnatanti recuperati dalle reazioni ATAC-seq. Evidenziamo la fattibilità dell'applicazione di queste tecniche per profilare il panorama epigenomico delle cellule recuperate dai biorepository di crioconservazione.

L'espressione genica è regolata dal legame dei fattori di trascrizione (TF) ai promotori prossimali e agli elementi regolatori distali come gli potenziatori. La struttura della cromatina ha una grande influenza sull'espressione genica controllando l'accesso dei TF ai siti di legame in questi potenziatori e promotori1. Modelli localizzati di modificazione epigenetica della cromatina, come la modificazione degli istoni, la metilazione del DNA e il rimodellamento dei nucleosomi, sono correlati all'attività di potenziamento, al legame del TF e alla regolazione della trascrizione. L'accessibilità della cromatina si riferisce al grado in cui le proteine ​​sono in grado di interagire fisicamente con la cromatina ed è fortemente influenzata dalle modifiche epigenetiche, dal posizionamento dei nucleosomi e dalle proteine ​​leganti la cromatina che limitano l'accesso al DNA2. La cromatina più accessibile o aperta è associata a regioni trascrizionali attive e ad elementi regolatori, mentre la cromatina chiusa è associata a regioni silenti o represse. Ad esempio, sebbene il DNA accessibile costituisca circa il 2–3% del genoma, cattura più del 90% delle regioni occupate dai TF analizzati nel progetto ENCODE2,3,4. L'accessibilità della cromatina è solitamente determinata sperimentalmente dalla suscettibilità della cromatina alla metilazione o alla scissione enzimatica. Tuttavia, i metodi convenzionali di profilazione della cromatina come DNase-seq richiedono milioni di cellule come requisito di input e comportano un flusso di lavoro complesso per la preparazione delle librerie. Il test della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) è un approccio relativamente nuovo a livello dell'intero genoma che analizza simultaneamente la struttura della cromatina (accessibilità e posizionamento del nucleosoma) e, soprattutto, il legame TF ad alta risoluzione con requisiti di input inferiori rispetto ad altre tecniche5,6 . Lo sviluppo di ATAC-seq ha reso possibile quantificare l'accessibilità della cromatina utilizzando un numero molto inferiore di cellule, rendendolo quindi adattabile al contesto clinico e alle popolazioni cellulari rare di interesse. La misurazione dell'accessibilità della cromatina alla risoluzione di una singola cellula è diventata possibile anche con lo sviluppo di strategie di sequenziamento ATAC a singola cellula (scATAC-seq)7,8,9. In ATAC-seq, la trasposasi Tn5, precaricata con adattatori di sequenziamento di nuova generazione, taglia e lega simultaneamente gli adattatori di sequenziamento nelle regioni di cromatina aperte accessibili5,6. I frammenti catturati tra gli adattatori possono quindi essere amplificati mediante PCR e sottoposti a sequenziamento ad alto rendimento5,6.