La crioconservazione delle isole pancreatiche mediante vetrificazione consente di ottenere elevata vitalità, funzionalità, recupero e scalabilità clinica per il trapianto

Nature Medicine volume 28, pagine 798–808 (2022) Citare questo articolo

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Il trapianto di isole pancreatiche può curare il diabete ma richiede isole accessibili e di alta qualità in quantità sufficienti. La crioconservazione potrebbe risolvere le sfide della catena di approvvigionamento delle isole consentendo operazioni bancarie di qualità controllata e la messa in comune delle isole donatrici. Sfortunatamente, la crioconservazione non è riuscita a raggiungere questo obiettivo, poiché deve fornire contemporaneamente un elevato recupero, vitalità, funzionalità e scalabilità. Qui, raggiungiamo questo obiettivo in isole beta derivate da cellule beta (SC-beta) di topo, suino, umane e umane mediante l'ottimizzazione completa della composizione dell'agente crioprotettivo (CPA), delle condizioni di carico e scarico del CPA e dei metodi per la vetrificazione e riscaldamento (VR). La vitalità delle isole post-VR, rispetto al controllo, è stata del 90,5% per il topo, del 92,1% per SC-beta, dell'87,2% per il suino e dell'87,4% per le isole umane, ed è rimasta invariata per almeno 9 mesi di conservazione criogenica. Le isole VR avevano una morfologia macroscopica, microscopica e ultrastrutturale normale. Il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di adenosina trifosfato (ATP) erano leggermente ridotti, ma tutte le altre misure della respirazione cellulare, compreso il tasso di consumo di ossigeno (OCR) per produrre ATP, erano invariate. Le isole VR avevano una normale funzione di secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) in vitro e in vivo. Le isole suine e SC-beta hanno prodotto insulina in modelli di xenotrapianto e le isole di topo testate in un modello di trapianto singenico di massa marginale hanno curato il diabete nel 92% dei riceventi entro 24-48 ore dopo il trapianto. È stato osservato un eccellente controllo glicemico per 150 giorni. Infine, il nostro approccio ha elaborato 2.500 isolotti con un recupero di isolotti >95% con una vitalità post-scongelamento >89% e può essere facilmente ampliato per una maggiore produttività. Questi risultati suggeriscono che la crioconservazione può ora essere utilizzata per fornire le isole necessarie per migliorare i risultati dei trapianti che curano il diabete.

Nonostante 100 anni di sviluppo terapeutico dalla scoperta dell’insulina, le attuali terapie per il diabete, come i monitor continui del glucosio, le pompe per insulina e i sistemi a circuito chiuso, rimangono un trattamento per la condizione piuttosto che una cura della malattia1. Sebbene negli ultimi decenni si siano visti progressi sostanziali nello sviluppo del trapianto di isole come potenziale cura per il diabete2, uno dei principali limiti di questo approccio è che i trapianti da un singolo donatore sono spesso insufficienti a raggiungere l’indipendenza dall’insulina nel ricevente3,4. Spesso sono necessarie due, tre o più infusioni di isole del donatore per un totale di 700.000 a >1 M di equivalenti di isole (IEQ) per un ricevente "tipico" di 70 kg5,6, aggiungendo rischi associati a interventi chirurgici ripetuti e cicli multipli di forte induzione di immunosoppressione.

Una strategia per superare il problema dell’offerta di donatori è quella di raggruppare le isole di più donatori, ottenendo un dosaggio elevato di isole con una singola infusione7,8, aumentando l’efficacia e riducendo il rischio. Sebbene diversi gruppi abbiano dimostrato la fattibilità della coltura delle isole per periodi prolungati (da settimane a mesi)9, la maggior parte ha segnalato un ridotto recupero delle isole e una perdita della funzione endocrina nel tempo10,11. Pertanto, ampi studi clinici spesso limitano la coltura a 48-72 ore prima del trapianto12. Questa incapacità di coltivare o conservare isolotti di alta qualità per più di pochi giorni dopo l’isolamento, tuttavia, rende logisticamente impraticabile il raggruppamento delle isole. Una seconda strategia è quella di sviluppare una fonte di isole alternativa, come le isole derivate da SC, che offrono l'entusiasmante promessa di una fornitura illimitata di isole13,14 e una minore dipendenza dalla disponibilità limitata dei donatori. Le isole derivate dalle SC producono insulina in risposta al glucosio, ripristinano la normoglicemia in alcuni modelli di trapianto animale e sono state testate in studi di fase 1 e 2 sull'uomo. Tuttavia, l'eterogeneità nella composizione delle cellule endocrine e la variabilità nella funzione13 portano a una notevole variabilità da lotto a lotto15, richiedendo un'ampia convalida pretrapianto di ciascun lotto, durante il quale le isole SC si deteriorano in coltura. L'incapacità di conservare le isole prima dell'uso è una sfida comune in entrambe le strategie. È necessario uno stoccaggio a lungo termine per superare le barriere della catena di approvvigionamento che limitano la disponibilità di quantità sufficienti di isole e per consentire un’adeguata valutazione della qualità prima del trapianto.

4 M) can lower the required CCR and CWR to attainable levels but cause toxicity in cells and tissues, especially at higher temperatures (>4 °C). Thus, there is a critical balance point that avoids both injury from ice and from CPA toxicity while maintaining clinical scalability. Previous islet vitrification strategies were limited to small volumes with low islet quantities (<150 islets in microliter volumes of CPA solution; Supplementary Table 1) to ensure sufficient cooling and warming rates, and volumetric scale-up reduced the cooling and warming rates and led to ice formation, compromising viability. To our knowledge, no published technique has simultaneously achieved islet cryopreservation with high viability, function and recovery in a clinically scalable protocol (Supplementary Table 1)./p>95% of the volume on the cryomesh, whereas 20 islets in a 2-µl droplet occupy only 1.8% of the total volume. Supplementary Table 2 summarizes the performance of cryomesh, droplet and cryotop VR approaches, emphasizing both the improved cooling and warming rates and the ability to scale-up the cryomesh./p>300,000 islets per batch (typical yields for single-donor isolation are <300,000 IEQs5); and adaptation to clinical-grade processing (details in Supplementary Results and Discussion). We believe each of these limitations will be readily overcome in future development./p>

400 mg dl−1. Marginal mass islet transplants of 250 islets per recipient51 were performed under the recipient mouse's left kidney capsule. For all treatment groups, islets were randomly selected for transplantation, including islets of all sizes, both morphologically disrupted and intact islets. BG measurements were made daily. Transplant success was measured on the first day of two successive daily measurements of BG < 200 mg dl−1. Graft failure was defined as the first day of two consecutive measurements >250 mg dl−1./p>