Imaging di bioluminescenza in vivo di batteri naturali all'interno dei tessuti profondi tramite ATP

Nature Communications volume 14, numero articolo: 2331 (2023) Citare questo articolo

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La maggior parte dei metodi di imaging della bioluminescenza esistenti possono solo visualizzare la posizione dei batteri ingegnerizzati in vivo, generalmente precludendo l'imaging dei batteri naturali. In questo caso, sfruttiamo i trasportatori di zucchero a cassetta che legano l'ATP specifici per i batteri per internalizzare la luciferasi e la luciferina facendoli fare l'autostop sull'unica fonte di carbonio dei batteri. Tipicamente, le sonde bioluminescenti sintetizzate sono costituite da polimero di glucosio (GP), luciferasi, Cy5 e nanoparticelle di silicio modificate con ICG e i loro substrati sono costituiti da nanoparticelle di silicio modificate con GP e D-luciferina. Rispetto ai batteri con mutazioni nei trasportatori, che difficilmente internalizzano le sonde in vitro (vale a dire, circa il 2% del tasso di assorbimento), vari batteri potrebbero fagocitare in modo efficace le sonde con un tasso di assorbimento elevato di circa il 50%. In particolare, la strategia sviluppata consente l’imaging in bioluminescenza ex vivo del vitreo umano contenente dieci specie di agenti patogeni raccolti da pazienti con endoftalmite batterica. Utilizzando questa piattaforma, differenziamo ulteriormente la nefrite e la colite batterica e non batterica nei topi, mentre le loro controparti chemiluminescenti non sono in grado di distinguerle.

I microrganismi svolgono molti ruoli vitali nella salute e nella malattia1,2,3,4,5,6. L'attività batterica in vivo è fortemente influenzata dalla loro posizione all'interno dell'organismo ospite. I metodi di imaging clinico esistenti come la tomografia computerizzata (CT), la risonanza magnetica (MRI) e possono fornire immagini non invasive delle infezioni batteriche nel corpo. Tuttavia, a causa della loro selettività relativamente scarsa, non sono in grado di distinguere l’infiammazione causata da infezioni batteriche dall’infiammazione causata da altre cause come il cancro o le malattie autoimmuni7,8,9,10. Recentemente, le tecniche di imaging ottico possono fornire informazioni batteriche localizzate, qualitative e quantitative a livello molecolare11,12,13,14. Essendo il metodo di imaging ottico più utilizzato, l'imaging a fluorescenza richiede eccitazione ottica in tempo reale, tuttavia, può portare all'autofluorescenza di fondo dei tessuti biologici, con conseguente rapporto segnale-fondo relativamente scarso15,16,17.

Attribuito all'eliminazione dell'irradiazione luminosa esterna, l'imaging a bioluminescenza (BLI) presenta numerosi vantaggi rispetto all'imaging a fluorescenza, come uno sfondo più basso e una sensibilità più elevata18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Ad oggi, i sistemi bioluminescenti per il rilevamento dei batteri possono essere sostanzialmente classificati in due tipologie: (1) il sistema endogeno BLI, che prevede l'ingegneria genetica dei batteri per esprimere le luciferasi29,30,31,32,33; (2) il sistema BLI esogeno, in cui l'autoluminescenza deriva dall'ossidazione dei substrati di luciferina esogena o luciferina in gabbia catalizzata dalla luciferasi esogena in presenza di adenosina trifosfato (ATP) batterico prodotto dalla lisi dei batteri34. Nonostante i grandi progressi del BLI, esso presenta dei limiti intrinseci nell'imaging batterico, come segue: "in primo luogo, i sistemi BLI endogeni necessitano della modificazione genetica dei batteri; in secondo luogo, i sistemi BLI esogeni necessitano della distruzione delle cellule batteriche per consumare il ATP intracellulare", non essendo quindi in grado di visualizzare batteri vivi29,30,31,32,33,34.

Un modo teoricamente promettente ma metodologicamente non sviluppato per visualizzare vari batteri naturali in vivo con la bioluminescenza consiste nel fornire selettivamente un reporter bioluminescente nelle cellule batteriche, consumando direttamente l'ATP all'interno dei batteri. Curiosamente, la strategia antibiotica del "cavallo di Troia" potrebbe fornire antibiotici legati al sideroforo nel citoplasma batterico attraverso i trasportatori del ferro dei batteri35,36,37,38,39,40,41. Nel nostro lavoro precedente, abbiamo dimostrato che le nanosonde modificate con polimero di glucosio (GP) possono essere internalizzate in vari batteri attraverso il percorso del trasportatore ABC specifico per i batteri, come riassunto nella Tabella Supplementare 142,43,44,45. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, l’uso di una strategia “cavallo di Troia” per fornire selettivamente indicatori bioluminescenti ai batteri non è stato segnalato prima.